建立腸病毒即時定量PCR之分析系統

王聖帆

2002年 第18卷 第11期

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摘要:

1998年夏天,台灣地區爆發了腸病毒的流行,雖然大部分的感染不會造成重大影響,但仍造成部份孩童有嚴重的感染症狀,甚至有死亡之個案。臨床上通常使用兩種方式來作鑑定診斷:一種是採用細胞培養感染(cell culture infectivity)[1],傳統的方法是將檢體處理後,接種到適合的細胞上,經過一段時間培養後觀察有無細胞病變(CPE)的現象,有CPE者再以免疫螢光法、中和反應或分子生物學技術來鑑定其感染源種類;另一種則採用分子生物診斷方式,例如:PCR[2]。目前實驗室發展出利用即時PCR(real-time PCR)的方法來直接偵測檢體中腸病毒,此方法為結合Taq –Man的技術與ABI Prism TM 7900即時序列偵測系統,特性為高敏感度、高專一性且節省人力與時間,其方法是根據腸病毒5’端non-coding region(此區為腸病毒高保守(high-conserved)區域)設計引子以單一步驟(one-step)的RT-PCR[3]增幅出約145bps 片段 , 同時以雙螢光標記的DNA探針(probe)與AmpliTaq DNA 聚合脢5’→ 3’ nucleolytic activity的特性,偵測具有特異性之PCR產物並可與已知量的標準線性比較而間接偵測出病毒量,為了要更準確的定出檢體中的病毒數量,本實驗使用Mahoney type 1 polivirus RNA作為standard並採用分子選殖(molecular cloning)的方法將此片段黏接到pGEM-T Easy Vector上。此方法的線性範圍約7-log dynamic range(101~107),並且適合用於篩檢大量的檢體,並且由於PCR反應後即可得知檢體中是否有特異性之產物,故可省略傳統方法在PCR反應後,還須進行PCR產物的分析,所以能更快速得知結果。