建立腸病毒即時定量PCR之分析系統

王聖帆

2002年 第18卷 第11期

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摘要：

1998年夏天，台灣地區爆發了腸病毒的流行，雖然大部分的感染不會造成重大影響，但仍造成部份孩童有嚴重的感染症狀，甚至有死亡之個案。臨床上通常使用兩種方式來作鑑定診斷：一種是採用細胞培養感染（cell culture infectivity）[1]，傳統的方法是將檢體處理後，接種到適合的細胞上，經過一段時間培養後觀察有無細胞病變（CPE）的現象，有CPE者再以免疫螢光法、中和反應或分子生物學技術來鑑定其感染源種類；另一種則採用分子生物診斷方式，例如：PCR[2]。目前實驗室發展出利用即時PCR（real-time PCR）的方法來直接偵測檢體中腸病毒，此方法為結合Taq –Man的技術與ABI Prism TM 7900即時序列偵測系統，特性為高敏感度、高專一性且節省人力與時間，其方法是根據腸病毒5’端non-coding region（此區為腸病毒高保守（high-conserved）區域）設計引子以單一步驟（one-step）的RT-PCR[3]增幅出約145bps 片段 , 同時以雙螢光標記的DNA探針（probe）與AmpliTaq DNA 聚合脢5’→ 3’ nucleolytic activity的特性，偵測具有特異性之PCR產物並可與已知量的標準線性比較而間接偵測出病毒量，為了要更準確的定出檢體中的病毒數量，本實驗使用Mahoney type 1 polivirus RNA作為standard並採用分子選殖（molecular cloning）的方法將此片段黏接到pGEM-T Easy Vector上。此方法的線性範圍約7-log dynamic range（101~107），並且適合用於篩檢大量的檢體，並且由於PCR反應後即可得知檢體中是否有特異性之產物，故可省略傳統方法在PCR反應後，還須進行PCR產物的分析，所以能更快速得知結果。